简单快速获得多形核粒细胞(PMNs)的方法

多形核粒细胞(PMNs)，主要是中性粒细胞，同时包括少量嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。

 

PMNs是血液循环中最丰富的白细胞，是对组织损伤和感染的第一反应细胞。在绝大多数情况下，面对病菌入侵PMN都能做出适当的反应，以保持体内平衡和机体健康。PMNs的浮力密度往往比单核细胞大得多（>1.085 g/ml），但是在利用分离液分离的过程中会遇到一个问题，就是红细胞的浮力密度往往在1.09 - 1.11 g/ml之间，这使得使用密度分离液从全血中分离PMNs变的很困难。

 

Serumwerk Bernburg AG 生产的Polymorphprep分离液的高渗透压可使红细胞失水而缩小，从而增大红细胞的有效浮力密度，同时分离液中的葡蔗糖能促使红细胞聚集并在溶液中快速沉降，随着离心过程红细胞会被逐渐沉降到底部，所以利用Polymorphprep分离液可以快速有效的获得PMNs。

 

红细胞在Polymorphprep中分离的过程

 

多形核粒细胞分离操作步骤：

1、血液样本的制备。

为了达到好的效果，使用抗凝全血，如EDTA，肝素或柠檬酸。EDTA 抗凝效果最佳。

2、将5毫升血液+ 5毫升分离液放入15毫升试管中，下层是分离液上层是血液。

3、500-550g离心30分钟，温度在18°C-22°C（允许转子在没有刹车的情况下减速）

4、离心后，可以看到两圈白膜层。上面PBMCs,下层是PMNs, 小心吸取PMN。

为使PMNs恢复正常渗透压，应加入1体积的0.45% NaCl溶液或0.5体积正常浓度的培养基进行稀释。如需进一步稀释，可使用生理盐水或培养基。

5 、将细胞悬浮液转移到一个15ml的试管中，加入2ml PBS, 400 g离心10分钟(18-22°C)，也可以被重悬在培养基中完成后续实验。

注意事项：

1、该分离液仅适用于人的未作稀释的血液，不适用于动物血液。

2、建议使用两小时内的新鲜血液，待分离血液和待用分离液的温度需要保持在18度-22度之间。

3、注意离心时间越长或离心力越大，会导致PMN进一步向红细胞处迁移。

4、这里使用15ml离心管，推荐用5 ml血液+ 5 ml分离液进行密度梯度离心，若使用50ml离心管，建议使用 18 ml 血液+18 ml Polymorphprep™。

 

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参考文献：

1.https://diagnostic.serumwerk.com/products/polymorphprep/

2.Noah Fine ¹, Nikola Tasevski ¹ The Neutrophil: Constant Defender and First Responder Front Immunol  2020 Sep 24;11:571085.  doi: 10.3389/fimmu.2020.571085.