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Annexin V常见问题分析及解决方案
人阅读 发布时间：2023-06-29 08:41
Annexin V常见问题分析及解决方案
不久前，发布了文章：Annexin V凋亡实验注意事项（点击查看), 给大家讲解了Annexin V实验中的注意事项，好多同学跟反馈说，这些细节问题我在实验的时候都注意了，但实验结果还是很不理想。
出现异常实验结果时，我们该怎么办呢？
我们需要认真对待失败的实验数据，分析总结实验失败的可能原因，这样才能有针对性地重新实验，得到理想的实验结果。
本篇文章将结合多年实验经验，为大家带来Annexin V的常见问题分析，通过实际案例，让大家更深入地了解Annexin V实验。
问题一:处理组晚期凋亡细胞分两群，缺少早期凋亡
可能原因：细胞处理条件太过剧烈，如：药物浓度过大、溶解药物的有机溶剂用量过大、极端条件（沸水等）处理细胞，导致细胞迅速死亡，呈现类似周期实验中细胞被固定的效果，缺少凋亡过程。
解决方案：温和处理细胞，如：降低药物浓度；有机溶剂（DMSO等）的量最好控制在5‰以下。
问题二： 缺少早期凋亡细胞，并且伴随大量坏死或裸核细胞
可能原因：药物处理时间过长，不耐药细胞凋亡后转向裸核，耐药细胞不再发生凋亡。
解决方案: 缩短药物处理时间（为保证凋亡效果，可以适当增加药物处理的剂量）。
问题三 : 核染（PI/7-AAD/DAPI）,无阳性信号
| 可能原因 | 解决方案 | |
| ①核染料忘记添加 | ①重新实验，注意添加核染料 | |
| ②试剂保存不当而失效，如7-AAD没在-20℃下保存 | ②重新购买试剂，注意试剂的保存条件 | |
| ③细胞确实没有凋亡 | ③重新调整细胞处理条件，可以借助显微镜观察细胞是否凋亡 | |
| ④阈值设置过大，凋亡信号没有收集到 | ④调整仪器设置，降低阈值 | |
| ⑤贴壁细胞培养液上清中的细胞没有收集 | ⑤重新实验，注意收集上清中的细胞 | |
问题四: 分群不明显
| 可能原因 | 解决方案 | |
| ①细胞带自发荧光 | ①更换其他标记的试剂盒 | |
| ②细胞凋亡过多导致染料不足 | ②增加染料用量 | |
| ③细胞状态较差，所有细胞都有一定的PS外翻 | ③培养、实验过程都需要温柔对待细胞 | |
问题五:空白组有荧光信号
| 可能原因 | 解决方案 | |
| ①流式细胞仪没有清洗干净 | ①彻底清洗仪器 | |
| ②荧光物质（如：阿霉素、四环素、细胞转染了带荧光的质粒等）干扰 | ②更换其他荧光标记的试剂盒，或者用其他物质培养细胞 | |
| ③凋亡或者坏死的本底荧光 | ③空白组应选用状态良好的正常细胞，如细胞状态过差无法恢复或存在污染，应及时更换细胞 | |
| ④细胞不纯 | ||
问题六: 正常细胞出现大量凋亡
| 可能原因 | 解决方案 | |
| ①细胞状态不佳 | ①调整细胞状态，重新培养细胞 | |
| ②实验操作时手法粗暴，或细胞消化过度 | ②温柔对待细胞 | |
| ③孵育时间过长，长时间处于非正常生长环境会导致细胞凋亡 | ③控制好实验的时间，如果样本太多，可以分批进行实验 | |
| ④Binding Buffer稀释的问题：buffer未正确稀释，溶液渗透压异常导致细胞凋亡 | ④按照说明书要求进行操作 | |
列举了一些Annexin V的常见问题分析及解决方案，希望对大家的实验有帮助~
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