RNA IQ与电泳方法的比较

Qubit RNA IQ可为RNA样品的降解与否提供一种快速而简便的方法 （图4）。 如需获取更为具体的RNA片段大小及分布信息，我们依然推荐您使用基于凝胶或微流体的电泳方法。 RNA IQ检测方法可提供与电泳方法相匹配的大小RNA或具有高级结构的RNA比例信息 （图5），但需要注意的是因为计算原理不同，相应的IQ#会与其他质量评估方法得到的结果之间存在差异 （图6）。 推荐对于RNA样品先通过RNA IQ进行检测，然后利用传统的电泳方法来确定检测结果与特定样品或下游应用之间的相关性。 RNA IQ与传统电泳方法之间的最主要区别在于确定RNA样品是否降解所需要的检测时间不同。 凝胶方法相对简单，但检测过程仍需更多时间。 基于微流体的方法不仅需要更多的结果等待时间，通常也需要更为漫长的样品制备过程。（表1）。 

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图 4.  通过Qubit RNA IQ检测试剂盒实时监测RNA的降解。  将RNase A与三组100 ng/μL的rRNA溶液重复样品进行孵育，并在特定的时间点加入RNase OUT以抑制RNase的活性。 样品通过Qubit RNA IQ检测试剂盒检测 （货号： Q33221，Q33222），Qubit 4荧光定量仪结果。 右图显示了在低浓度RNase条件下的RFU值（右上），其中，随着RNA发生降解，大片段和/或具有高级结构的染料荧光维持在初始信号水平，而小片段RNA染料的荧光信号增强。 下图显示了在高浓度RNase条件下，大片段和/或具有高级结构的染料荧光信号降低较快，而小片段RNA染料的荧光信号增强。 

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图 5. 通过Qubit RNA IQ检测试剂盒或Agilent Bioanalyzer™仪器对经RNase处理的rRNA完整性及质量进行评估。 每组100 ng/mL的rRNA （E.coli）溶液中加入了750 fM的Rnase A并在随后不同的时间点加入了RNase OUT，最后通过在Qubit 4荧光定量仪(A)上使用Qubit IQ检测试剂盒或Agilent Bioanalyzer™ Prokaryote Total RNA Nano芯片 (B,C,D)进行检测。

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图 6.  在RNase处理1分钟之后，通过使用Qubit RNA IQ以及Agilent Bioanalyzer™进行总RNA完整性及质量的评估。  使用0.5pg/µL RNase A对rRNA进行处理，并在1分钟后加入RNaseOUT。  样品通过Prokaryote Total RNA Nano芯片或Qubit RNA IQ检测试剂盒检测 （货号：Q33221，Q33222），Qubit 4荧光定量仪结果。 不同质量评分系统的差异， IQ#： 9.8而RIN#： 8.9是由于5s rRNA以及tRNA也存在三级结构而会与大RNA染料结合所导致的。
 

表 1. Qubit 4荧光定量仪与Agilent Bioanalzyer用于RNA样品质量评估的比较。 

仪器与检测试剂盒	Qubit 4荧光定量仪及Qubit RNA IQ检测试剂盒	Agilent 2100 Bioanalyzer™ 及RNA Nano芯片*
检测所需的设备及试剂*	Qubit 4 荧光定量仪 Qubit RNA IQ检测试剂盒  移液器 Qubit分析管	Agilent 2100 Bioanalyzer检测仪 RNA 6000 Nano检测试剂盒 移液器 小型离心管 芯片启动站 IKA涡旋仪 小型离心机 计算机 热盖仪或水浴 无RNA酶的水
设备设置	打开Qubit 4荧光定量仪	依次用新的DNA试剂盒替换芯片启动站上的注射器 调整芯片启动站的底盘 调整芯片启动站的注册器夹 调整Bioanalyzer芯片选择器 设置涡旋混合仪 加入芯片前启动软件
样品处理时间：	~5 分钟	~30-45分钟
样品制备	加入RNA IQ染料至RNA IQ缓冲液中，制备Qubit RNA IQ工作缓冲液 加入样品[1-20uL（0.5-1.5ug）]和标准品至Qubit RNA IQ工作溶液中	制备RNA ladder 制备凝胶 （包含10min的离心） 制备凝胶及染料预混液（包含10min的离心） 加入凝胶及染料预混液至芯片中 加入marker至芯片中 加入RNA ladder及样品 （包含1min的IKA涡旋）
样品稳定性	~1 小时	在5分钟内使用芯片
分析运行时间	每个样品 <4 秒	每个芯片30分钟
常规维护	无	每月需要进行密封性测试以检测芯片启动站的性能 对于电泳检测方法： 使用电极清理器来每天清理电极 每月通过使用牙刷及蒸馏水来进行电极的彻底清理 每月一次（或在任何液体溢出后）用异bing醇来清理聚焦滤镜
维护所需要的产品	无	RNaseZAP (电极清理）
*相关信息获取自Agilent G2938-90037及G2946-90003用户手册，以及Thermo Fisher Scientific MAN0017210快速查询卡片。